一、技术概述

RAP（RNA亲和纯化）是一种基于生物素标记RNA探针的高效技术，用于特异性富集与目标RNA分子直接结合的蛋白质或其他RNA分子。通过将生物素标记的RNA探针与样本孵育，结合链霉亲和素磁珠捕获RNA-蛋白复合物，结合质谱（MS）或高通量测序（RNA-seq）分析，可全面解析RNA的相互作用网络。该技术广泛应用于非编码RNA功能研究、RNA-蛋白互作机制解析及疾病靶点筛选。

二、实验目的

本实验利用生物素标记的lncRNA HG互补探针组结合lncRNA HG 同时将与其

互作的核酸、蛋白复合物一起沉淀下来；后续通过二代测序或质谱验证捕获到的

核酸或蛋白。

三、实验流程

1. 细胞交联

a. 用1ml PBS重悬细胞；

b. 加28ul 37%甲醛（终浓度为1%）进行交联，室温翻转孵育10min；

c. 加入10×甘氨酸至终浓度为1×；室温翻转孵育5min，终止交联；

d. 4℃，3000g，离心3min；弃上清液；

e. 用1ml预冷的1X PBS重悬细胞，用3000g，4℃，5min离心，去上清。

f． 重复e步骤一遍（此步骤沉淀可冻存于-80℃）；

2. 细胞裂解及去除基因组

a. 用800ul lysis Buffer(使用前加入2ul蛋白酶/磷酸酶抑制剂;4ulRNase Inhibitor)重悬细胞；冰上充分裂解10min；

b. 加入20 ulD DNase、9ul RNA Digest Buffer;常温37℃孵育10min;

c. 将样本转移到冰上，并加入45ul stop solution;

3. 探针准备

a. 用DEPC处理水溶解探针；

b. 混合探针组，使探针组终浓度为：40 pmol/探针

c. 取4ul探针组到一个新的EP管， 85℃变性 3 分钟后，快速转移至冰浴。

d. Probe组及Bead组分别加入2倍体积的 Hybridization buffer，加入5uL RNase inhibitor及8ul 蛋白酶抑制剂，65℃温育变性 10 min；加入步骤c已变性好的探针37℃杂交 30 min;

e. 50℃温育变性 5 min，37℃杂交3h；

4. 磁珠准备

a. 颠倒混匀磁珠，并转移30ul磁珠到一个新的EP管中

b. 将EP管置于磁力架上静置约1min，进行磁性分离；

c. 吸除上清，并加入60ul A液重悬磁珠，然后进行磁性分离；

d. 吸除上清，并加入30ul B液重悬磁珠，然后进行磁性分离;

e. 吸除上清，并加入30ul C液重悬磁珠，然后进行磁性分离;

f. 重复步骤5；

g. 吸除上清，并用步骤3孵育好的裂解液重悬磁珠，室温翻转孵育30min;

h. 磁性分离，吸除上清；

i. 加入500ul Wash Buffer洗涤磁珠5次；

j. 加入50ul Elution buffer 进行洗脱

k. 产物用于银后续质谱检测或提核酸后进行测序检测

四、技术优势

高特异性与灵敏度

灵活性与兼容性

高通量潜力

多维度分析

四、适用范围

1️⃣ 非编码RNA功能解析

2️⃣ 疾病机制与靶点发现

3️⃣ 病毒-宿主互作研究天然产物功能研究

4️⃣ 基础分子机制探索

六、代表性实验结果

七、客户提供

1细胞样品＞4×107；动物组织＞100mg（黄豆粒大小）；植物组织＞5g2物种信息及基因信息

（注：组织样品需液氮速冻、保存于-80度，样品使用干冰寄送）

广州如期生物技术有限公司成立于2016年，始终以探索科学、服务客户为己任；致力于为高校、科研院所、医院、制药企业提供全面、便捷、专业的技术服务和产品。技术方面我们专注于生物医学领域：公司拥有完善的技术服务平台，覆盖分子生物学，转录组学、代谢组学、蛋白组学，表观遗传等多个科研平台。在产品方面，自主研究多种类型科研试剂盒20多项，如：COIP、CHIP、RIP等科研检测试剂盒，较之同类型的进口试剂盒，极大的降低了科研成本。